Detección de Virus de PRRS

Las técnicas de detección de virus proporcionan un indicador útil de la enfermedad, aunque algunas se utilizan principalmente como herramientas de investigación porque son laboriosas, caras y lentas. Uno de estos ejemplos es el aislamiento del virus, que utiliza estirpes celulares específicas para amplificar virus de muestras tisulares a través de un proceso de infección y replicación (76). Otro es la microscopia electrónica, que puede tener un papel importante en la caracterización de nuevas cepas no reconocidas por técnicas moleculares o de anticuerpos específicas. En la actualidad se utilizan ampliamente técnicas más recientes, rápidas y menos costosas, que son más prácticas para el diagnóstico oportuno y rutinario, y que se describen a continuación.

Reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa
La reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) es un método rápido, específico y de alta sensibilidad utilizado para detectar el PRRSv en distintos tejidos (que incluyen suero, semen, fluidos bucales, pulmón, fetos, ganglios linfáticos, bazo y amígdalas), y también en muestras ambientales. El proceso implica la extracción de ARN vírico de la muestra biológica, conversión a ADN por transcriptasa inversa, amplificación por PCR y detección de ADN amplificado.



Un inconveniente de la técnica RT-PCR consiste en que la ventana para la detección del virus después de la infección difiere entre los tejidos de los que se obtienen muestras y entre animales. La infección de animales jóvenes y animales seronegativos por PRRSv provoca cargas víricas detectables mayores y más persistentes que en animales maduros (77). Además, la alta sensibilidad de la RT-PCR puede provocar falsos positivos por contaminación, mientras que la especificidad de cebadores puede dar lugar a falsos negativos para algunos virus genéticamente diversos (78). Puesto que estos datos pueden afectar significativamente a las decisiones de manejo de grupos, se aconseja la realización de pruebas secundarias de muestras empleando estrategias alternativas cuando proceda. La RT-PCR tampoco puede distinguir entre el virus natural y el atenuado (79), un aspecto que es especialmente relevante al evaluar el PRRSv en muestras ambientales.

Inmunohistoquímica
La inmunohistoquímica (IHQ) se usa conjuntamente con microscopia para detectar la presencia de PRRSv en tejido procedente de varias localizaciones, tales como pulmón, ganglios linfáticos, timo, amígdala, bazo y riñón (80). Normalmente, los tejidos se fijan inicialmente con formalina (aunque también pueden utilizarse tejidos recién obtenidos), y después se marcan con anticuerpos monoclonales dirigidos a la nucleocápside del virus. Su visualización se lleva a cabo empleando un anticuerpo secundario marcado. Aunque la IHQ tiene una alta especificidad (100 %), solo muestra una sensibilidad moderada (67 %) (81). No obstante, esto puede mejorarse procesando los tejidos en las 48 horas siguientes a la fijación (82). La sensibilidad es mayor en los estadios precoces de la infección, pero se reduce progresivamente durante los estadios posteriores, como más de 28 días posinfección (DPI), por lo que no se recomienda después de 90 DPI (83). Aunque la IHQ es eficaz en la identificación del virus transmitido verticalmente en lechones, quizá no sea eficaz con algunas cepas aisladas genéticamente diversas.



Tinción con anticuerpos fluorescentes
La tinción con anticuerpos fluorescentes (AF), que suele utilizarse para la evaluación de fluido de LBA o tejido pulmonar reciente/congelado (84), se utiliza escasamente en la actualidad. En esta técnica, las muestras se marcan directamente con anticuerpos fluorescentes para visualizar las nucleocápsides. Este proceso es más rápido y más barato que la IHQ para la determinación del PRRSv, pero, como sucede con la IHQ, es posible que no pueda detectar cepas aisladas genéticamente diversas y no se recomienda en los estadios más avanzados de la infección. Además, los falsos positivos también pueden ser un problema debido a la poca especificidad del anticuerpo principal o la elevada tinción de fondo. En ambos casos, las pruebas positivas se confirman idealmente empleando RT-PCR (o aislamiento del virus).


 
Tiras reactivas para diagnóstico sobre el terreno
Las tiras reactivas para diagnóstico sobre el terreno son un avance relativamente nuevo en el diagnóstico del PRRSv y, aunque todavía no se utilizan ampliamente, pueden proporcionar una detección cómoda y rápida del PRRSv sin necesidad de experiencia o equipos especializados. Las tiras reactivas para el diagnóstico sobre el terreno detectan el virus en homogeneizados de tejido o suero por inmunocromatografía. Las muestras se mezclan con anticuerpos monoclonales marcados con oro dirigidos a proteínas del PRRSv específicas, y forman complejos proteína-anticuerpo que quedan atrapados en las tiras (85). Seguidamente, se detectan estos complejos con un anticuerpo secundario marcado. En estudios realizados en China, las tiras reactivas han demostrado una sensibilidad superior al 93 % y una especificidad por encima del 96 % (86), aunque en la actualidad solo existen datos para una gama limitada de virus.