Individuare il virus

Le tecniche di rilevazione del virus forniscono un indicatore utile della malattia, sebbene alcune (essendo laboriose, costose e lente) siano utilizzate essenzialmente come strumenti di ricerca. Un esempio è rappresentato dall’isolamento virale, che utilizza linee cellulari specifiche per amplificare i virus ottenuti da campioni di tessuto, attraverso un processo di infezione e replicazione. Un altro esempio è costituito dalla microscopia elettronica, che può svolgere un ruolo importante nella caratterizzazione di nuovi ceppi non riconosciuti mediante approcci molecolari o anticorpali specifici. Sono ora di uso comune nuove tecniche, rapide e meno costose (descritte  in seguito), che risultano più pratiche per la diagnosi tempestiva di routine.

Reazione a catena della polimerasi con trascrittasi inversa
La reazione a catena della polimerasi con trascrittasi inversa (RT-PCR) è un metodo rapido, altamente sensibile e specifico utilizzato per rilevare il PRRSv in svariati tessuti (fra cui siero, seme, fluidi orali, polmone, feti, linfonodi, milza e tonsille), nonché in campioni ambientali. Il processo prevede l’estrazione dell’RNA virale dal campione biologico, la conversione in DNA mediante trascrittasi inversa, l’amplificazione mediante PCR e la rilevazione del DNA amplificato.



Uno svantaggio della RT-PCR è costituito dal fatto che la finestra per la rilevazione del virus dopo l’infezione risulta diversa sia da un tessuto campionato all’altro che da un animale all’altro. Negli animali giovani e negli animali mai venuti a contatto con il PRRSv, l’infezione determina cariche virali rilevabili più elevate e più durature rispetto agli animali maturi. Inoltre, l’elevata sensibilità della RT-PCR può determinare risultati falsi positivi dovuti alla contaminazione, mentre la specificità dei primer può determinare risultati falsi negativi per alcuni virus che presentano diversità genetica. Poiché questi dati possono influire in maniera significativa sulle decisioni riguardanti la gestione dell’allevamento, è opportuno, effettuare test secondari dei campioni con l’ausilio di strategie alternative. La RT-PCR non è inoltre in grado di distinguere fra virus di campo (wild type) e virus attenuato.

Immunoistochimica
L’immunoistochimica (IHC) viene utilizzata unitamente alla microscopia per rilevare il PRRSv nei tessuti provenienti da diverse sedi, fra cui polmone, linfonodi, timo, tonsille, milza e rene. Generalmente, i tessuti vengono dapprima fissati in formalina (sebbene si possano utilizzare anche tessuti freschi) e quindi marcati con anticorpi monoclonali che hanno come bersaglio il nucleocapside virale. Questi vengono visualizzati utilizzando un anticorpo secondario tracciato. L’IHC, pur avendo un’elevata specificità (100%), mostra una sensibilità soltanto modesta (67%), che può però essere migliorata lavorando i tessuti entro 48 ore dalla fissazione. La sensibilità è massima nei primi stadi dell’infezione, ma diminuisce progressivamente durante gli stadi successivi, come per esempio oltre 28 giorni post-infezione (DPI), quindi l’immunoistochimica non è raccomandata dopo 90 giorni DPI. Pur essendo efficace nell’individuare il virus trasmesso verticalmente nei suinetti, l’IHC può non essere efficace per alcuni isolati che presentano diversità genetica.



Colorazione a immunofluorescenza
La colorazione a immunofluorescenza (FA), usata generalmente per la valutazione di BAL o di tessuto polmonare fresco/congelato, è oggi utilizzata di rado. Con questa tecnica, i campioni vengono marcati direttamente con anticorpi fluorescenti per visualizzare i nucleocapsidi. Questo processo risulta più veloce e più economico rispetto all’IHC per misurare il PRRSv, ma, come per l’IHC, può non rilevare isolati che presentano diversità genetica e non è raccomandato negli ultimi stadi dell’infezione. Inoltre, i falsi positivi possono rappresentare un problema, a causa della scarsa specificità dell’anticorpo primario o dell’elevata colorazione di fondo. In entrambi i casi, l’ideale è confermare i test positivi con l’ausilio della RT-PCR (o dell’isolamento virale).
 


Test su striscia di campo
I test su striscia di campo sono uno sviluppo relativamente nuovo nella diagnostica del PRRSv e, sebbene non siano ancora di uso comune, possono potenzialmente offrire una rilevazione rapida e comoda del PRRSv senza la necessità di competenze o apparecchiature specialistiche. I test su striscia di campo rilevano il virus nel siero o in omogenati tissutali mediante immunocromatografia. I campioni vengono mescolati ad anticorpi monoclonali marcati con oro che hanno come bersaglio specifiche proteine del PRRSv, formando complessi proteina-anticorpo che vengono catturati sulle strisce. I complessi catturati vengono poi rilevati con l’ausilio di un anticorpo secondario marcato. In alcuni studi condotti in Cina, i test su striscia hanno dimostrato una sensibilità superiore al 93% e una specificità superiore al 96%, sebbene siano disponibili dati aggiornati soltanto per una gamma limitata di virus.