Het aantonen van het virus

Methoden die het virus zelf kunnen aantonen, zijn handig om vast te stellen of een dier ziek is. Sommige van deze methoden worden echter vrijwel alleen bij wetenschappelijk onderzoek ingezet, omdat ze arbeidsintensief zijn, duur zijn en veel tijd kosten. Dat is bijvoorbeeld het geval bij virusisolatie. Daarbij worden specifieke cellijnen gebruikt om virussen uit weefselmonsters te amplificeren, via een proces van infectie en replicatie. Een ander voorbeeld is elektronenmicroscopie. Deze methode kan zeer handig zijn voor het karakteriseren van nieuwe stammen die door bepaalde moleculaire technieken of antistofbepalingen niet worden herkend. Tegenwoordig wordt er op grote schaal gebruikgemaakt van verschillende nieuwere, snellere en minder dure technieken. Voor screening en vroegtijdige diagnose zijn dat namelijk handigere opties. Deze technieken zijn hieronder beschreven.

Reverse-transcriptasepolymerasekettingreactie
De reverse-transcriptasepolymerasekettingreactie (RT-PCR) is een snelle en uiterst sensitieve en specifieke methode voor het aantonen van PRRSv in uiteenlopende soorten weefsels (o.a. serum, sperma, speeksel, longen, foetussen, lymfeklieren, de milt en tonsillen) en in omgevingsmonsters. Bij deze methode wordt virus-RNA uit het biologische monster gehaald en vervolgens door reverse-transcriptase omgezet in DNA. Dit DNA wordt daarna via de polymerasekettingreactie geamplificeerd, waarna de aanwezigheid ervan kan worden aangetoond.



Een nadeel van RT-PCR is dat het per weefselsoort en per varken kan verschillen gedurende welke periode na het oplopen van de infectie het virus kan worden aangetoond. Bij geïnfecteerde varkens die jong zijn of nog nooit eerder met PRRSv geïnfecteerd zijn geweest, is de hoeveelheid virusdeeltjes in het lichaam hoger en langer aantoonbaar dan bij volwassen varkens. Doordat de RT-PCR zo gevoelig is, bestaat er bovendien kans op fout-positieve uitslagen als gevolg van contaminatie. Tevens kan de specificiteit van gebruikte primers bij bepaalde genetisch afwijkende virussen een fout-negatieve uitslag opleveren. Zulke uitslagen kunnen grote nadelige gevolgen hebben voor beslissingen op bedrijfsgezondheidsgebied. In sommige gevallen is het noodzakelijk om de monsters met een andere testmethode nogmaals te testen. Een ander nadeel is dat RT-PCR geen onderscheid kan maken tussen het wildtype van het virus en de geattenueerde vorm. Dit is vooral van belang wanneer omgevingsmonsters gebruikt worden voor het testen op PRRSv.

Immuunhistochemie
Immuunhistochemie (IHC) wordt samen met microscopie gebruikt voor het aantonen van PRRSv in bepaalde soorten weefsel, zoals weefsel uit de longen, lymfeklieren, thymus, tonsillen, milt en nieren. Doorgaans worden de weefselmonsters eerst gefixeerd met formaline (al kan er ook vers weefsel gebruikt worden) en vervolgens gelabeld met monoklonale antistoffen die zich tegen de nucleocapside van het virus richten. Om de monoklonale antistoffen zichtbaar te maken wordt een gelabelde secundaire antistof gebruikt. Hoewel de specificiteit van IHC uiterst hoog is (100%), is de sensitiviteit maar matig (67%). De sensitiviteit kan echter verbeterd worden door de weefselmonsters binnen 48 uur na het fixeren te verwerken. De sensitiviteit is het hoogst in het beginstadium van de infectie en verslechtert vervolgens (vanaf  28 dagen na het optreden van de infectie) gedurende de latere stadia. Deze test is vanaf 90 dagen na het oplopen van de infectie niet meer aan te raden. Hoewel IHC bij biggen virus kan aantonen dat via verticale transmissie is overgedragen, zal deze test bepaalde genetisch afwijkende isolaten wellicht niet herkennen.



Directe immunofluorescentie
Directe immunofluorescentie, vooral gebruikt voor het testen van broncho-alveolaire spoelvloeistof of vers/bevroren longweefsel, wordt tegenwoordig nog maar zelden toegepast. Bij deze methode worden monsters rechtstreeks met fluorescerende antistoffen gelabeld om zo aanwezige nucleocapsiden zichtbaar te maken. Hoewel controle op PRRSv op deze manier sneller gaat en goedkoper is dan bij gebruik van IHC, worden genetisch afwijkende isolaten mogelijk niet herkend en is deze methode niet aan te bevelen voor de latere stadia van een infectie. Bovendien bestaat er kans op fout-positieve uitslagen als gevolg van onvoldoende specificiteit van de primaire antistof of te sterke achtergrondkleuring. Voor beide situaties geldt dat een positieve uitslag bij voorkeur bevestigd wordt door middel van RT-PCR (of virusisolatie).
 


Teststrips voor gebruik op het bedrijf
Teststrips die op het bedrijf zelf gebruikt kunnen worden, zijn een relatief nieuwe methode voor het vaststellen van PRRSv. Ze worden momenteel nog niet op brede schaal gebruikt, maar kunnen PRRSv snel en op eenvoudige wijze aantonen. Men hoeft niet over specialistische kennis of apparatuur te beschikken om deze testmethode te kunnen gebruiken. De teststrips kunnen door middel van immunochromatografie de aanwezigheid van virus in serum of weefselhomogenaat aantonen. Bij deze test worden monsters gemengd met gouddeeltjes die gelabeld zijn met monoklonale antistoffen tegen een specifiek PRRSv-eiwit. Hierbij worden antigeen-antistofcomplexen gevormd, die zich aan de teststrip zullen binden. Met behulp van een gelabelde secundaire antistof kunnen de gebonden complexen vervolgens worden waargenomen. Bij Chinese onderzoeken bleken de sensitiviteit en specificiteit van de teststrips respectievelijk ruim 93% en ruim 96% te zijn. Vooralsnog zijn er echter slechts gegevens over enkele virussen bekend.