Speekselonderzoek

In 1997 werd voor het eerst vermeld dat het mogelijk is om speekselmonsters te gebruiken voor het diagnosticeren van PRRSv. Hier wordt alleen het gebruik in relatie tot PRRSv besproken, maar het is goed om te onthouden dat speekselmonsters ook bij vele andere ziekten diagnostisch gezien van waarde zijn. Zo hebben Prickett et al. vermeld dat onderzoek gedaan is naar het gebruik van speekselmonsters bij klassieke varkenspest, het vesiculaire-stomatitisvirus, het mond-en-klauwzeervirus, Actinobacillus pleuropneumoniae en PCV2.

Het afnemen van speeksel

Beknopte handleiding voor het verzamelen van speekselmonsters van varkens

Meer info

Controle van serum op PRRSv-specifieke antistoffen is de meest gebruikte methode voor het vaststellen van PRRS, maar in plaats van serum is het ook mogelijk speeksel of transsudaat uit spierweefsel te gebruiken.  In de VS wordt speekselonderzoek tegenwoordig dan ook ruim tien keer zo vaak gebruikt als in 2010 het geval was (afbeelding 1).

Afbeelding 1. Het aantal speekselonderzoeken verricht door Iowa State University, US

 
Hoewel de term ‘speekselonderzoek’ gebruikt wordt, gaat het niet alleen om speeksel, maar ook om transsudaat uit de slijmvliezen in de bek. Het daadwerkelijke speeksel bestaat grotendeels uit water met daarin enzymen die de vertering van het voer in gang zetten. In het transsudaat uit haarvaten in het slijmvlies en tandvlees is de aanwezigheid en concentratie van in het serum aanwezige antistoffen, hormonen, geneesmiddelen en virussen af te lezen. Stoffen uit het serum komen zeer snel via passieve transsudatie in het speeksel terecht, waardoor er maar weinig verschil bestaat tussen het moment waarop het virus en de antistoffen in het serum verschijnen en het moment waarop ze in het speeksel verschijnen.



Niet alle speekselmonsters zijn gelijkwaardig. De samenstelling wordt namelijk beïnvloed door de manier waarop en de plaats waar het monster genomen wordt. Bij verwijzing naar speekselmonsters, gaat het om vocht uit de mondholte dat met behulp van absorptiemateriaal verzameld is. Bij varkens is de eenvoudigste manier hiervoor het aanbieden van een katoenen touw waarop de dieren kunnen kauwen. Dit is een eenvoudige, snelle, goedkope en niet-invasieve methode. Uitstrijken van de wangen en tonsillen worden hier niet beschouwd als speekselmonsters.
Alle soorten varkens zullen bij gebruik van kauwtouwen zonder problemen speekselmonsters afgeven. De monsternameprocedure is speciaal afgestemd op de lichamelijke, gedragsmatige en huisvestingsverschillen die tussen de verschillende leeftijdsgroepen bestaan.  Meestal worden de touwen gedurende 20-30 minuten opgehangen. Dat is lang genoeg om veel van de dieren op het touw te laten kauwen en kort genoeg om te voorkomen dat het speeksel verdampt. De dikte van
het touw stemt men af op de grootte van de dieren. Zo wordt voor zeugen een touwdiameter van 1,3 cm geadviseerd en vleesvarkens en beren een touwdiameter van 1,6 cm. De touwen horen op schofthoogte te hangen. Als de varkens enigszins hun best moeten doen om bij het touw te kunnen komen, verkleint dat de kans op contaminatie van het monster. Volgens ongepubliceerde waarnemingen van dr. Jeffery Zimmerman kunnen de touwen ook gebruikt worden om speekselmonsters te verkrijgen van zogende biggen. De touwen dienen dan wel op een plek te worden gehangen waar de zeug er ook bij kan. Dit vergroot namelijk de interesse en bereidheid van de biggen om erop te kauwen.
In een populatie met een lage prevalentie heeft het aantal varkens dat het touw gebruikt invloed op de sensitiviteit van de test en de kans dat het virus wordt aangetoond.
Bij onderzoek werd voor het touw een oplossing met smaakstof gebruikt (ongezoet appelsap met sacharose). Het gebruik hiervan leek de sensitiviteit niet aan te tasten, maar het effect ervan werd niet officieel onderzocht.
Bij monsternameprotocollen voor dekberen dient rekening te worden gehouden met het risico dat van beren die niet meewerken, nooit een monster wordt verkregen; bij deze dieren kan het nodig zijn om alsnog op conventionele wijze monsters te nemen.
Volgens Kittawornrat et al. had infectie met een milde PRRSv-stam geen negatief effect op de kans dat er een speekselmonster verkregen werd, maar wel een negatief effect op de hoeveelheid speeksel die verkregen werd. Voorafgaand aan de infectie werd gemiddeld 17,6 ml (bereik: 4 tot 38 ml) speeksel verkregen, en na het oplopen van de infectie gemiddeld 15,7 ml (bereik: 1 tot 37 ml). Gezien het feit dat de optimale hoeveelheid speeksel 4 ml bedraagt en naar verluidt bij alle monsternames voldoende speeksel werd afgenomen voor een qRT-PCR-test op PRRSv, lijkt de kans klein te zijn dat er als gevolg van een lichte PRRSv-infectie zo weinig speeksel wordt verkregen dat het niet kan worden getest. Ernstige infecties zullen vermoedelijk eerder op basis van klinische tekenen aan het licht komen dan op basis van periodieke screening.
De kauwtouwen dienen van katoen te zijn, omdat dit materiaal veel vocht opneemt. Volgens publicaties mogen geen gebleekte touwen worden gebruikt. Het is onduidelijk waarom het niet opvolgen van deze adviezen nadelig zou zijn voor het functioneren van de diagnostische test. Varkenshouders hebben echter allerlei touwen voorhanden en wanneer van touwsoort veranderd wordt kan dat wellicht resulteren in fout-negatieve uitslagen zonder dat vermoed wordt dat het touw daarvan de oorzaak zou kunnen zijn. Om dit probleem te voorkomen, is duidelijke afstemming tussen de varkenshouders, dierenartsen en de veterinaire
diagnostische laboratoria noodzakelijk. Speekselmonsters die zichtbare deeltjes bevatten, dienen te worden gecentrifugeerd voordat ze worden ingeleverd en getest. Diagnostici hebben laten weten dat er tussen speekselmonsters grote verschillen lijken te bestaan. Sommige zijn zeer helder, terwijl andere vlokkig zijn. Deze waargenomen verschillen kunnen vergroot zijn door inconsistentie ten aanzien van het centrifugeren van monsters. Er is geen informatie bekend over de invloed die de kwaliteit of consistentie van monsters heeft op de sensitiviteit van de test. Zulke informatie zou handig zijn voor het bepalen van de betrouwbaarheid van de test. Het zou zinvol zijn om verder onderzoek te doen naar de invloed die de touwsoort, de voorbehandeling van het touw en het centrifugeren van monsters hebben op de testresultaten.
Nadat het touw uit het hok gehaald is, wordt het uitgewrongen in een plastic zak en wordt het vocht vervolgens in een buis (Falcon 2054 of een vergelijkbare buis) gegoten. Zonder zorgvuldig te handelen, kan er kruiscontaminatie van de verzamelde monsters optreden. Hoewel dit geen gevolgen zal hebben voor de diagnostiek op bedrijfsniveau, kan hierdoor wel de prevalentie binnen het bedrijf te hoog worden ingeschat. Verzamelde speekselmonsters die binnen 24 uur getest zullen worden, dienen gekoeld te worden bewaard, en monsters die pas later getest zullen worden, dienen te worden ingevroren. Gedurende een observatieperiode
van 12 dagen werden bij onderzoek de hoogste virusconcentraties en S/P-ratio’s aangetroffen bij monsters die bewaard werden bij een temperatuur beneden 10 ºC. Bij +20 ºC werden middelmatige resultaten gevonden en bij +30 ºC de slechtste. Er werden geen aanmerkelijke verschillen gevonden tussen een bewaartemperatuur van -20 ºC en een bewaartemperatuur van +10 ºC.
 
Directe PRRSv-testen
De virusconcentratie in het speeksel is gecorreleerd aan die in het serum, maar lager. Bij onderzoek bleek de virusconcentratie in speeksel op dag 0 lager te zijn dan die in serum, en op dag 14 en dag 21 na het optreden van de infectie respectievelijk vergelijkbaar te zijn aan en hoger te zijn dan die in serum.
Onder praktijkomstandigheden kunnen deze verschillen vergroot worden door factoren als gedeeltelijke immuniteit, de leeftijd, aanwezigheid van meerdere virusstammen en een verschil in de lengte van de periode tussen het optreden van de infectie en de monstername. Aan de ene kan zou gesteld kunnen worden dat verder onderzoek noodzakelijk is, aangezien de berekende sensitiviteit overschat kan worden wanneer geen rekening wordt gehouden met dergelijke variatie. Aan de andere kant hebben we binnen de diagnostiek altijd al te maken gehad met natuurlijke variatie, en hebben we in het verleden ook niet met het beschikbaar stellen van diagnostische testen gewacht totdat alle vormen van variatie in de dagelijkse praktijk in kaart waren gebracht.
Speekselmonsters zijn bij varkenshouders onder de aandacht gebracht als een hulpmiddel bij het screenen op een vroeg stadium van een PRRSv-infectie. De gevoeligheid van speekselonderzoek in een vroeg infectiestadium wordt beïnvloed door de lagere virusconcentratie die in die periode in het speeksel aanwezig is en door de mogelijke verdunning die optreedt als er in een steekproefgroep van 20 varkens of meer slechts enkele positieve dieren zitten.
Aangezien de bevindingen van Wang et al. bij een onderzoek op een varkensbedrijf niet volledig gestaafd konden worden, zijn er nog observationele onderzoeken nodig om de waarschijnlijkheid van vroegtijdige opsporing van PRRSv te bevestigen.
Bij het onderzoek werden 3 varkensbedrijven onderzocht. Op elk van de bedrijven werden van dieren uit 6 hokken elke 3 weken 1 speekselmonster en 5 bloedmonsters genomen. Bij 2 van de 3 bedrijven werd in het merendeel van de hokken PRRSv aangetoond in het serum en het speeksel dat tijdens hetzelfde monsternamebezoek was afgenomen. Bij 1 van de 3 bedrijven bleken bij het eerste bezoek waarbij PRRSv werd aangetroffen, alle 6 de hokken volgens de qRT-PCR met serum positief te zijn, terwijl volgens het speekselonderzoek alle 6 de hokken negatief waren.
De tijd tot het moment waarop PRRSv kan worden aangetoond lijkt voor speeksel en serum vergelijkbaar te zijn. Het virus was bij 10% van de beren detecteerbaar binnen 1 dag, bij 76% binnen 2 dagen, en bij 94% binnen 3 dagen na het oplopen van de infectie. Dit was vergelijkbaar met de 100% positiviteit van serummonsters op 3 dagen na het oplopen van de infectie (n = 70).
Opvallend was dat het aandeel speekselmonsters dat op 14 en 21 dagen na het oplopen van de infectie nog positief was, significant hoger was dan het aandeel serummonsters. Dit doet vermoeden dat het detectievenster voor speekselmonsters enigszins ruimer is dan dat voor serummonsters (gemiddelden van meerdere onderzoeken: 94% voor speeksel t.o.v. 80% voor serum op dag 14, en 90% voor speeksel t.o.v. 79% voor serum op dag 21). Deze bevinding houdt mogelijk verband met de manier van testen van het monster. Speekselmonsters op filterschijfjes bleken namelijk op dag 19 na het oplopen van de infectie onbetrouwbaar te zijn geworden.
  
Indirecte PRRSv-testen

Voor het gebruik van een ELISA-test voor het aantonen van antistoffen tegen PRRSv in speeksel bestaat slechts beperkt en voorlopig bewijs. Prickett et al. vermeldden geen aanmerkelijk verschil in ELISA-uitkomsten tussen speekselmonsters van voor onderzoeksdoeleinden geïnoculeerde varkens en speekselmonsters van controlevarkens. Uit drie recentere congrespublicaties waaraan gedeeltelijk dezelfde onderzoekers meewerkten, bleek dat de ELISA-test
gebruikt kan worden. In een van de publicaties stond dat de IDEXX 2XR-test voor controle op antistoffen na aanpassing bij gebruik van speeksel een diagnostische sensitiviteit van circa 80% en een diagnostische specificiteit van circa 100% kan bereiken. Volgens een andere van de publicaties kan in speekselmonsters de aanwezigheid van PRRS-specifieke IgG-, IgM- en IgA-isotopen worden aangetoond. De derde publicatie ging over monsters die getest waren door het veterinaire diagnostische laboratorium van de Amerikaanse Iowa State University. De monsters waren afkomstig van dieren uit twee hoogprevalente en twee laagprevalente
bedrijven. De exacte prevalentie werd niet vermeld. Op elk bedrijf werden 3 leeftijdsgroepen onderzocht, en per leeftijdsgroep werden 6 hokken bemonsterd. Bij de hoogprevalente bedrijven waarvan ELISA-gegevens bekend waren, werd voor diagnoses gebaseerd op 5 serummonsters per hok en diagnoses gebaseerd op 1 speekselmonster een correlatie van 50 tot 100% gevonden. De gemiddelde S/P-ratio bij serummonsters, de gemiddelde S/P-ratio bij speekselmonsters en de hokspecifieke correlatie namen tussen week 6 en week 8, en tussen week 8 en week 10 toe met de leeftijd. Bij de laagprevalente bedrijven werden weinig positieve uitslagen gevonden.