Dịch xoang miệng - chẩn đoán PRRS

Năm 1997, dịch xoang miệng được báo cáo lần đầu như một mẫu chẩn đoán đối với virus PRRS. Khởi đầu, nó chỉ giới hạn cho PRRS, nhưng hiện các mẫu dịch xoang miệng đã có giá trị trong chẩn đoán nhiều bệnh. Prickett và cộng sự đã hướng dẫn dùng dịch xoang miệng trong kiểm tra dịch tả heo, virus gây viêm mụn nước ở miệng, virus LMLM, APP, và PCV2 . 

Thu thập mẫu dịch xoang miệng

hướng dẫn nhanh để thu thập mẫu dịch trên heo

More info

Phát hiện kháng thể đặc hiệu với virus PRRS trong huyết thanh là phương pháp thông thường nhất trong chẩn đoán PRRS, các mẫu dịch xoang miệng hoặc dịch tiết từ mô cũng có thể được sử dụng. Tuy nhiên, chẩn đoán thông qua mẫu dịch xoang miệng đã tăng gấp 10 lần kể từ năm 2010 tại Mỹ (hình 1).

Hình 1. Số lượng mẫu xét nghiệm dịch xoang miệng tại đại học Iowa, IA, Mỹ 


 
Dịch xoang miệng là hỗn hợp nước bọt và chất tiết dịch nhầy. Nước bọt chứa nhiều enzyme giúp bắt đầu quá trình tiêu hóa thức ăn. Những dịch tiết từ mao quản trong niêm mạc miệng và lợi phản ánh sự có mặt và nồng độ của kháng thể trong huyết thanh, hormone, thuốc và virus. Quá trình tiết thụ động các thành phần trong huyết thanh tới dịch xoang miệng là kết quả phản ánh mối tương quan giữa thời gian xuất hiện virus và kháng thể trong huyết thanh và dịch xoang miệng.



Không phải tất cả các mẫu được thu thập từ xoang miệng là bằng nhau, điều này còn tùy thuộc vào phương pháp và vị trí lấy mẫu. Dịch xoang miệng là dịch bên trong khoang miệng được thu thập thông qua việc sử dụng thiết bị hấp thu. Ở heo điều này rất dễ bằng cách dùng một dây cotton cho chúng nhai. Cách này đơn giản, nhanh ít tốn kém và không bị vấy nhiễm. Việc lấy dịch bên trong má và hạch amidan thì không được coi là dịch xoang miệng.
Tất cả các loại heo lấy dịch xoang miệng đều thông qua nhai dây. Tiến trình lấy dịch khác nhau giữa các nhóm heo. Dây thường được treo từ 20-30 phút, đủ dài để chắc chắn có nhiều heo tiếp xúc với dây. 
Đường kính của dây và loại heo lấy mẫu phải tương đương, chẳng hạn khoảng 1,3cm cho heo cai sữa và 1,6cm cho heo thịt và heo nọc. Dây nên treo bằng vai của heo và ở chỗ có ánh sáng để heo dễ thấy, hạn chế tối đa sự vấy nhiễm mẫu. Một nghiên cứu không được công bố bởi tiến sỹ Jeffery Zimmerman chỉ ra rằng dây có thể được sử dụng để thu thập dịch xoang miệng từ những heo con đang bú, nhưng dây nên treo ở nơi con nái có thể chạm vào để tăng sự quan tâm của heo con và giúp chúng nhai.
Số lượng heo con đến nhai dây tác động tới độ nhạy và tỷ lệ phát hiện virus trong những quần thể có sự lây lan thấp.
Phương pháp sử dụng dung dịch có hương liệu như nước táo chua pha đường, không gây ảnh hưởng đến độ nhạy, nhưng hiện vẫn chưa được khẳng định chính thức.
Lấy mẫu trên đực giống có thể gặp thất bại trên những nọc chưa từng được lấy mẫu, do vậy nên chỉ áp dụng các phương pháp lấy mẫu truyền thống.
Kittawomrat và cộng sự đã phát hiện ra rằng nhiễm PRRS độc lực trung bình sẽ không ảnh hưởng tới tỷ lệ thành công của việc thu thập dịch xoang miệng nhưng làm giảm đi tổng số dịch thu thập. Trung bình thu được 17,6 ml (dao động 4 - 38 ml) khi lấy mẫu được lấy trước khi nhiễm và 15,7 ml (dao động 1-37 ml) sau khi nhiễm. Số lượng tối ưu của dịch xoang miệng là 4ml, và tất cả các lần thu thập được báo cáo là đủ dịch xoang miệng cho xét nghiệm pRT-PCR PRRSv. Nhiễm PRRS độc lực nhẹ có thể dẫn đến sự thiếu hụt mẫu khi xét nghiệm. Do vậy, sự nhiễm trùng trầm trọng sẽ được nhận diện bởi triệu chứng lâm sàng hơn là các giám sát thường quy.
Những dây thu thập mẫu nên làm bằng cotton vì nó có khả năng thấm hút cao. Các dây phải không được dùng chất tẩy rửa. Hiện không rõ ảnh hưởng của việc không tuân thủ các hướng dẫn trên có ảnh hưởng gì tới kết quả chẩn đoán hay không nhưng việc người chăn nuôi sử dụng dây sẵn có trong trại và loại dây sự dụng thay đổi có thể dẫn đến hiện tượng âm tính giả mà không có bất cứ nghi ngờ nào. Do vây, cần có sự thống nhất giữa chủ trại, bác sỹ thú y và bác sỹ phòng thí nghiệm. Mẫu dịch xoang miệng nên được ly tâm trước khi mang tới xét nghiệm. Kỹ thuật viên phòng xét nghiệm phải có nhận xét về tình trạng mẫu, chẳng hạn như mẫu rất sạch hay mẫu có kết tủa. Quá trình ly tâm không đều sẽ gây ảnh hưởng đến kết quả chẩn đoán. Tuy nhiên, ảnh hưởng của chất lượng và tính ổn định của mẫu thu thập lên độ nhạy của xét nghiệm thì chưa được báo cáo. Thông tin này rất có giá trị trong việc đánh giá độ tin cậy của chẩn đoán. Do đó, cần thêm nhiều nghiên cứu về tác động của các loại dây khác nhau, cách xử lý dây và ly tâm mẫu  nhằm mang lại kết quả xét nghiệm có giá trị.
Khi dây được tháo khỏi chuồng, nó sẽ được vặn vào túi nilong và dịch sẽ chảy vào trong túi (ống Falcon 2054 hoặc tương đương). Nếu không xử lý cẩn thận bước này, các mẫu thu thập có thể bị nhiễm chéo. Đây không phải là vấn đề lớn trong chẩn đoán ở cấp độ toàn đàn nhưng có thể dẫn đến những dự đoán sai về độc lực trong từng đàn. Những dịch thu thập được xét nghiệm trong vòng 24 giờ nên được để ngăn mát, nhưng nếu chưa xét nghiệm ngay thì nên để đông đá. Qua 12 ngày quan sát, nồng độ virus cao nhất và chỉ số SP được thấy trong các mẫu dưới +10 oC, kết quả trung bình ở +20 oC và kém nhất ở +30oC. Khoảng giữa +20oC và +10oC thì không thấy có sự khác biệt.
 
Kiểm tra PRRS trực tiếp
Lượng virus trong dịch xoang miệng bằng hoặc ít hơn trong huyết thanh. Nồng độ virus  trong dịch xoang miệngthấp được trong huyết thanh ở ngày 0, và tương đồng ngày 14, và cao hơn ở 21 ngày sau nhiễm.
Trong thực tế tại trại, sự biến thiên có thể do miễn dịch từng phần, độ tuổi, nhiễm nhiều chủng cùng lúc và thời gian thu thập mẫu sau khi heo nhiễm bệnh. Hiện cần nhiều nghiên cứu hơn nữa vì mọi sự xem xét thiếu cẩn trọng có thể dẫn tới việcước đoán sai lệch độ nhạy. Tuy nhiên, sự biến thiên tự nhiên luôn xuất hiện trong những kết quả chẩn đoán và chúng ta không nên hoãn các xét nghiệm chẩn đoán đến tận khi tất cả sự biến thiên môi trường được giải thích rõ.
Dịch xoang miệng được xem như một công cụ để nhận diện sớm sự nhiễm virus PRRS. Điều này có nghĩa là độ nhạy của xét nghiệm bị ảnh hưởng bởi cả nồng độ virus thấp trong mẫu dịch và độ pha loãng với chỉ vài mẫu dương tính trong một mẫu gộp 20 hoặc nhiều hơn.
Nghiên cứu của Wang và cộng sự không đủ chứng cứ tại trại, nên việc chắc chắn phát hiện sớm virus PRRS thông qua mẫu dịch xoang miệng nên được xác nhận thông qua những thử nghiệm quan sát cụ thể.
Nghiên cứu trên 3 đàn heo thông qua sự thu thập 1 mẫu dịch xoang miệng và 5 mẫu máu từ 6 chuồng, cách nhau khoảng 3 tuần. Virus PRRS được phát hiện ở 2 trong ba đàn kiểm tra trên mẫu huyết thanh và dịch xoang miệng trong cùng một lần lấy mẫu. Nhưng trong lần lấy đầu tiên có 1 trong 3 đàn đã phát hiện virus PRRS dương tính khi chạy qRT-PCR mẫu huyết thanh ở tất cả 6 chuồng nhưng cả 6 mẫu dịch xoang miệng thì âm tính.
Thời gian phát hiện virus PRRS trong dịch xoang miệng tương đương trong mẫu huyết thanh. Virus được phát hiện khoảng 10% trên heo đực ở 1 ngày sau nhiễm, 76% ở 2 ngày sau nhiễm và 94% ở 3 ngày sau nhiễm, 100% mẫu huyết thanh dương tính ở 3 ngày sau nhiễm (n-70).
Tỷ lệ mẫu dịch xoang miệng dương tính ở 14 ngày và 21 ngày cao hơn trên mẫu huyết thanh cho thấy khả năng phát hiện virus trong dịch xoang miệng có thể dài hơn trong huyết thanh (trung bình các thử nghiệm: dịch xoang miệng 94% so với huyết thanh 80% ở 14 ngày và dịch xoang miệng 90% so với huyết thanh 79% ở 21 ngày). Tuy nhiên, điều này có thể còn tùy thuộc vào mẫu được xét nghiệm như thế nào, và kết quả xét nghiệm dịch xoang miệng trên đĩa lọc không có độ tin cậy cao ở 19 ngày sau nhiễm.
 
 
Các xét nghiệm gián tiếp virus PRRS

Kiểm tra kháng thể PRRS trong mẫu dịch xoang miệng bằng kỹ thuật ELISA có hạn chế. Prickett và cộng sự đã báo cáo không có sự khác biệt trong các kết quả ELISA giữa mẫu dịch xoang miệng được thu thập từ những heo gây bệnh thực nghiệm và heo đối chứng. Trong 3 hội nghị gần đây đã có vài nhà nghiên cứu chỉ ra rằng xét nghiệm ELISA có thể được sử dụng. Bộ kít IDEXX 2XR Ab Test có thể được sử dụng kiểm tra mẫu dịch xoang miệng với độ nhạy lên tới 80% và độ đặc hiệu đến 100%. Báo cáo thứ 2 chỉ ra rằng có thể xác định các isotopes của IgG, IgM và Ig A đặc hiệu với PRRS từ các mẫu dịch xoang miệng. Báo cáo thứ 3 tổng kết thông tin mẫu xét nghiệm tại phòng thí nghiệm chẩn đoán đại học Iowa. Mẫu được thu thập từ đàn nhiễm virus độc lực thấp và đàn nhiễm độc lực cao. Trong mỗi đàn, mẫu được thu thập từ 6 ô chuồng với 3 nhóm tuổi khác nhau. Trên đàn nhiễm độc lực cao, lấy 5 mẫu huyết thanh mỗi chuồng và 1 mẫu dịch xoang miệng tương ứng, xét nghiệm ELISA cho kết quả tương ứng là 50% và 100%. Chỉ số S/P trung bình ở các mẫu huyết thanh, và mẫu dây nhai tăng dần theo tuổi từ 6 tới 8 rồi tới 10 tuần. Một số ít mẫu dương tính đã được báo cáo ở đàn nhiễm thấp.